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PPA制備與使用的基本技術(shù)
(1) 將初步純化的SPA與HRP用過碘酸鈉氧化法(交聯(lián)反應(yīng)時間在22℃下5h)交聯(lián)。
(2) 將上述PPA溶液過Sephadex G-100柱,條件同前。所收集的第1管至第22管的合并液,是PPA存在的主要組分,可用ELISA塑料平板法檢測活性。將合并液濃縮,然后加入30%左右甘油,貯于4℃冰箱備用
PPA的使用
(1) PPA-ELISA法?;旧吓cELISA法相同,PPA代替了酶標(biāo)抗抗體。在進(jìn)行微量反應(yīng)板測定時,PPA常常加入0.1ml,稀釋度一般在1:2至1:100(應(yīng)按不同情況試驗)。PPA與IgG是化學(xué)共價結(jié)合,反應(yīng)時間不宜過長,不應(yīng)超過2h,控制在30min-60min,反應(yīng)時間過長會使PPA吸附到塑料載體上去。
(2) 用PPA進(jìn)行組織內(nèi)有關(guān)抗原的定位。甲醛對PPA有顯色影響,因此組織不可用甲醛固定,可用甲醛、乙醇等。PPA對組織內(nèi)抗原(先與IgG結(jié)合)的定位,反應(yīng)時間可以延長,便于滲透入組織細(xì)胞內(nèi),且沒發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的物理吸附現(xiàn)象。
(3) 在PPA實驗中稀釋液常用含0.5%(v/v)Tween20的0.02mol/L Ph 7.4 Tris-HC1緩沖液(2.42gTris溶于蒸餾水后用0.1N HC1調(diào)pH至7.4,然后加蒸餾水定容至1000ml,zui后加0.5ml Tween 20)。
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