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非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)(B 盒)
【獸藥名稱(chēng)】 通用名稱(chēng):非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒(B 盒)
漢語(yǔ)拼音:Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe(B He)
英文名稱(chēng):African Swine Fever Virus Real-time RCR Detection Kit 商品名稱(chēng):無(wú)
【主要成分與含量】
組成 組份 規(guī)格
熒光 PCR 反應(yīng)液 1000µL/管×1 管
Taq 酶 30µL /管×1 管 B 盒 陰性對(duì)照 1000µL/管×1 管
陽(yáng)性對(duì)照 1000µL /管×1 管
說(shuō)明書(shū) 1 份/盒
【作用與用途】用于血液、血球粉、淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體中非洲豬瘟病毒核酸的檢測(cè)。
【用法與判定】 1 用法 1.1 樣品處理 血液樣品直接用;淋巴結(jié)、脾臟、扁桃體樣品,用無(wú)菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品 2.0g 于研 缽中充分研磨,再加 10.0mL PBS(pH7.2,含 1 萬(wàn)單位青霉素和 1 萬(wàn)單位鏈霉素)混勻(樣品不足 2.0g 按 1:5 比例加 PBS),對(duì)處理的待檢樣品置 70℃,30 分鐘滅活后,3000r/min,4℃離心 5 分鐘, 取上清液,編號(hào)備用;血球粉處理同上,只不過(guò)省掉研磨步驟。 1.2 樣品存放 采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò) 24h;若需長(zhǎng)期保存,須放置-80℃冰箱, 但應(yīng)避免反復(fù)凍融(凍融不超過(guò) 3 次)。 1.3 操作步驟 1.3.1 病毒 DNA 的提取 病毒 DNA 的提取推薦使用本公司生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒(A 盒),操作步驟 參照說(shuō)明書(shū)。如客戶(hù)自備提取試劑,請(qǐng)參考相應(yīng)提取試劑的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取好的 DNA 須在 2h 內(nèi)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,若需長(zhǎng)期保存須放置 -80℃冰箱,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 1.3.2 熒光 PCR 擴(kuò)增 (1)從試劑盒取出熒光 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶,室溫融化后,2000r/min 離心 5 秒。設(shè)所需 PCR 管數(shù)為 n(n=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照),每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系需要 20µL 熒光 PCR 反應(yīng)液 和 0.5µl Taq 酶。計(jì)算好各試劑的使用量,加入一適當(dāng)體積小管中,充分混合均勻后,向每個(gè) PCR 管中各分裝 20µL。 (2)分別向上述 PCR 管中加入 1.3.1 中制備的 DNA 溶液各 5µL,蓋緊管蓋,500r/min 離心 30 秒。(3)將加樣后的 PCR 管放入熒光 PCR 檢測(cè)儀內(nèi),作好標(biāo)記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置: 第一階段,預(yù)變性 95℃/3 分鐘 第二階段,95℃/15 秒,60℃/35 秒共 45 個(gè)循環(huán)。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的 60℃延伸 時(shí)進(jìn)行。 2 判定2.1 結(jié)果分析條件的設(shè)定 閾值設(shè)定原則:根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整,以閾值線剛好超過(guò)陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn) 為準(zhǔn)。對(duì)于多通道熒光 PCR 儀,選定 FAM(465-510)檢測(cè)通道讀取檢測(cè)結(jié)果,ABI 儀器選擇 FAM 獸用無(wú)熒光淬滅基團(tuán)。 2.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 2.2.1 陰性對(duì)照無(wú) Ct 值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。 2.2.2 陽(yáng)性對(duì)照的 Ct 值應(yīng)小于等于 28,并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。 2.2.3 如陰性和陽(yáng)性對(duì)照不滿(mǎn)足以上條件,此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。 2.3 結(jié)果判定 2.3.1 陰性:無(wú) Ct 值,且無(wú)特征性擴(kuò)增曲線,表明樣品為陰性。 2.3.2 陽(yáng)性:Ct 值≤38.0,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,表示樣本為陽(yáng)性。 2.3.3 Ct 值大于 38.0,且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線的樣品建議復(fù)驗(yàn)。復(fù)驗(yàn)仍出現(xiàn)上述結(jié)果的,判為 陽(yáng)性,否則判為陰性。
【注意事項(xiàng)】 1 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少分為三個(gè)區(qū):樣品處理區(qū)、反應(yīng)混合物配制區(qū)和檢測(cè)區(qū)。 2 各區(qū)物品均為專(zhuān)用,不得交叉使用,避免污染。檢測(cè)結(jié)束后,應(yīng)立即對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。 3 Buffer A 有很強(qiáng)的腐蝕性,切勿沾到皮膚或衣服上,否則應(yīng)立即用大量清水沖洗并擦干。 4 在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中應(yīng)注意避免交叉污染:提取核酸時(shí)應(yīng)用滅菌的鑷子夾取離心管;對(duì)離心管 開(kāi)蓋時(shí)應(yīng)避免粘在手上或?yàn)R出,否則要立即更換手套。 5 反應(yīng)液在使用前要*融化,并將反應(yīng)液與 Taq 酶瞬時(shí)離心將液體甩至管底。分裝反應(yīng)液時(shí), 應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡。上機(jī)前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄漏污染儀器。 6 陽(yáng)性對(duì)照在吸取前應(yīng)在微量漩渦振蕩器上劇烈振蕩 1~2 秒。 7 試劑盒中各組分應(yīng)避免反復(fù)凍融。 8 對(duì)樣品及其廢棄物的操作應(yīng)嚴(yán)格遵守生物安全規(guī)定。 9 本試劑盒僅供獸醫(yī)及相關(guān)專(zhuān)業(yè)人士使用。
【貯藏與有效期】非洲豬瘟病毒熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒(B 盒)在-20℃保存,有效期為 12 個(gè)月。
【規(guī)格】48 檢測(cè)/盒。
【批準(zhǔn)文號(hào)】獸藥生字 191478858
僅供獸醫(yī)診斷使用