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超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒說明書微量法
注意:正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。
規(guī)格:100T/96S
產(chǎn)品內(nèi)容:
試劑一:液體 20mL×1 瓶,4℃避光保存;
試劑二:粉劑 ×1 支,4℃避光保存;臨用前使用20ml試劑一充分溶解,配好的試劑4℃避光可保存一周。
試劑三:液體 110μL×1 支,4℃保存;臨用前將試劑三用蒸餾水稀釋10 倍,用多少配多少。試劑四:液體 2.5mL×1 瓶,-20℃保存。
試驗中所需的儀器和試劑:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾
水
產(chǎn)品說明:
SOD(EC 1.15.1.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用,生成 H2O2 和 O2。SOD 不僅是超氧化物陰離子清除酶,也是 H2O2 主要生成酶,在生物抗氧化系統(tǒng)中具有重要作用。
通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子(O2-.),O2-.可與 WST-8 反應(yīng)產(chǎn)生水溶性染料甲臜,后者在 450nm 處有吸收;SOD 可清除 O2-.,從而抑制了甲臜的形成;反應(yīng)液黃色越深,說明SOD 活性愈低,反之活性越高。
操作步驟:
一、樣品的前處理:
(1)細菌、細胞或組織樣品的制備:
先收集細菌或細胞到離心管內(nèi),離心后棄上清,按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液(生理鹽水或者PBS),超聲波破碎(功率 20%或 200w,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次)。8000g 4℃離心 10 分鐘,取上清, 置冰上待測。
稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液(生理鹽水或者PBS)進行冰浴勻漿; 8000g 4℃離心 10 分鐘,取上清,置冰上待測。
(2)血清(漿)樣品:直接檢測二、測定操作表:
1.分光光度計/酶標儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 450nm,蒸餾水調(diào)零。
2.測定前將試劑一、二和四 37℃水浴 5min 以上。
3.樣本測定(按順序加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 1 | 對照管 2 | 對照管 3 |
樣本 | 10 | |||
蒸餾水 | 10 | 10 | 10 | |
試劑三(稀釋后) | 10 | 10 | 10 | 10 |
試劑四 | 20 | 20 | 20 | 20 |
試劑二 | 160 | 160 | 160 | 160 |
充分混勻,室溫靜置 30min 后,450nm 處測定各管吸光值 A。
注意事項:
1、試劑三為酶,不可冷凍,使用時在冰上放置。
2、對照管只需要做三管,求平均值。
3、SOD 為什么有的樣本測定管大于對照管,對照管數(shù)值在什么范圍?對照管的范圍是 0.4-1。對照管吸光值過低可能是:
(1)試劑三活性低,可以適當(dāng)減少稀釋倍數(shù);
(2)沒有按順序加試劑;
(3)反應(yīng)時間不夠,可以延長反應(yīng)時間(反應(yīng)時間可以延長到 40min)。
(4)對照管吸光值過高可能是試劑三未按操作說明書稀釋相應(yīng)倍數(shù)。
(5)可能是樣本中雜質(zhì)的影響太大,為了降低雜質(zhì)的影響一般,將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋 10 倍后再測,通常可以使測定正常。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
SOD 活性計算:
1、抑制百分率的計算
抑制百分率=(A 對照管-A 測定管) ÷A 對照管× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在 10-90%范圍內(nèi)。如果計算出來的抑制百分率小于 10%或大于90%,則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高,則需將樣本用提取液適當(dāng)稀釋;如果測定出來的抑制百分率偏低,則需重新準備濃度比較高的待測樣本。
2、SOD 酶活性單位:在上述黃嘌呤氧化酶藕聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為 50%時,反應(yīng)體系中的SOD
酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。
3、SOD 酶活性計算:
血清(漿)SOD 活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V 反總]÷V 樣
=20×抑制百分率÷(1 -抑制百分率) 組織、細菌或培養(yǎng)細胞SOD 活力計算:
按樣本蛋白濃度計算
SOD 活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V 反總]÷(V 樣×Cpr )
=20×抑制百分率÷(1 -抑制百分率)÷Cpr
需要另外測定,建議使用上海研謹生物科技有限公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。按樣本鮮重計算
SOD 活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V 反總]÷(W ×V 樣÷V 樣總)
=20×抑制百分率÷(1 -抑制百分率)÷W c.按細菌或細胞個數(shù)計算
SOD 活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率) ×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)
=0.04×抑制百分率÷(1 -抑制百分率)
V 反總:反應(yīng)體系總體積,0.2mL;
V 樣:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.01mL;
V 樣總: 加入提取液體積,1 mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL ;
W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數(shù),500 萬。
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