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微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書
MicroGel Extraction Kit
目錄號: K0524
保 存: 室溫
組分說明
Cat.No. K0524
KitSize 50
BufferPG 50ml
BufferPS 15ml
BufferPW(concentrate) 10ml
BufferEB 10ml
SpinColumnDS 50
CollectionTube(2ml) 50
產(chǎn)品簡介
本試劑盒于從普通或低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收純化微量DNA+#片段,溶膠速度快,并利用硅基質(zhì)膜技術(shù),以非常小的終洗脫體積(可少至 10 μl),從瓊脂糖凝膠中,快速純化 50bp-50kb 的 DNA+#片段,純化過程有效去除引物、寡核苷酸、酶等雜質(zhì),從而可獲得高純度、高濃度,完整性好的 DNA,回收率高達(dá) 90%。本試劑盒回收純化的 DNA 可直接用于測序、連接和轉(zhuǎn)化、酶切、標(biāo)記、體外轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)實(shí)驗。
注意事項
1. *次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在 BufferPW 中加入無水乙醇。
2.使用前請檢查 BufferPG 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀,如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象,可在 37℃水浴幾分鐘,即可恢復(fù)澄清。
3.電泳時使用新的電泳緩沖液,以免影響電泳和回收效果。
4.切膠時,紫外照射時間應(yīng)盡量短,以免對 DNA 造成損傷。
5.回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關(guān)。
6.所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。
自備:無水乙醇,異丙醇,離心管
操作步驟
1. 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分),放入干凈的離心管(自備)中,稱取重量。
注意:若膠塊的體積過大,可將膠塊切成碎塊。
2. 向膠塊中加入3倍體積Buffer PG;當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度>2%時,建議使用6倍體積Buffer PG(如凝膠重為100mg,其體積可視為100μl,依此類推)。
3. 50℃孵育10分鐘,其間不斷溫和地上下顛倒離心管,以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊,可再補(bǔ)加一些BufferPG或繼續(xù)放置幾分鐘,直至膠塊*溶解。
注意:在膠充分溶解后檢測 pH 值,若 pH 值大于 7.5,可向含有 DNA 的膠溶液中加 10-30 μl 的 3 M 醋酸鈉(pH 5.0)將 pH 值調(diào)到 5-7。
4. 加入1倍膠體積異丙醇,上下顛倒混勻(如凝膠為100mg,則加入100μl異丙醇)。
5. 柱平衡:向已裝入收集管(CollectionTube)中的吸附柱(SpinColumnDS)中加入200 μl Buffer PS,12,000rpm(~13,400×g)離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱重新放回收集管中。
6. 將步驟4中所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中,室溫放置2分鐘,12,000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。
注意:吸附柱容積為700 μl,若樣品體積大于700 μl可分批加入。
7. 吸附柱中加入500 μl Buffer PG,12,000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。
8. 向吸附柱中加入650 μl Buffer PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇),12,000rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將吸附柱放回收集管中。
注意:如果純化的DNA是用于鹽敏感的實(shí)驗,例如平末端連接實(shí)驗或直接測序,建議加入Buffer PW后靜置2-5分鐘再離心。
9.12,000rpm離心2分鐘,倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘,以*晾干。
注意:這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除,乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)。為確保下游實(shí)驗不受殘留乙醇的影響,建議將吸附柱開蓋,置于室溫放置數(shù)分鐘,以*晾干吸附材料中殘余的乙醇。
10.將吸附柱放到一個新離心管(自備)中,向吸附膜中間位置懸空滴加10 μl Buffer EB(pH8.5),室溫放置2分鐘。12,000rpm離心1分鐘,收集DNA溶液。-20℃保存DNA。
注意:1)洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液,應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)。
2)為了提高DNA的回收量,可將離心得到的溶液重新加回吸附柱中,重復(fù)步驟10。
3)洗脫體積不應(yīng)小于10 μl,體積過少會影響回收效率。
4)如果使用TE洗脫,需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。
5)回收大于10 kb的DNA+#片段時,Buffer EB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱,適當(dāng)延長吸附和洗脫時間,可增加回收效率。
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