HiFiScript快速去基因組cDNA*鏈合成試劑盒說明書

HiFiScript Quick gDNA Removal

cDNA Kit

HiFiScript快速去基因組cDNA*鏈合成試劑盒

目錄號：YJ2582

保存條件：-20℃。

規(guī)格說明

     Cat. No.                    YJ2582-25       YJ2582-100

     Kit Size                         25              100

     gDNA Eraser                    12.5 μl          50 μl

     10×gDNA Eraser Buffer           30 μl           120 μl

     HiFiScript，200 U/μl             25 μl           100 μl

     5×RT Buffer                    120 μl           500 μl

     Primer Mix                      30 μl           120 μl

     RNase-Free Water                1 ml            2×1 ml

        本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途  

產(chǎn)品簡介

　　本產(chǎn)品是用于去除基因組DNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的試劑盒。該試劑盒在42℃，2 min即可

除去基因組DNA。同時由于反轉(zhuǎn)錄試劑中含有抑制gDNA  Eraser的組分，經(jīng)過   gDNA

Eraser處理后的樣品可以直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。本試劑盒配有新型反轉(zhuǎn)

錄酶HiFiScript，新穎突變位點大幅提升酶的轉(zhuǎn)錄活性，  cDNA*鏈合成的效率和產(chǎn)

量更高，可利用pg級的總RNA或mRNA合成cDNA*鏈。如逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA用于下

游熒光定量檢測，可在42℃，15min完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。本試劑盒適用于*鏈 cDNA的

合成和后續(xù)的RT-PCR、RT-qPCR、以及全長cDNA文庫的構(gòu)建等。

產(chǎn)品特點

1．快速去除基因組：含有去除基因組DNA的gDNA  Eraser，只需 2 min即可除去基因

   組DNA。

2．快速逆轉(zhuǎn)錄：15分鐘即可獲得熒光定量PCR模板cDNA*鏈合成。

3．靈敏度高：可利用pg級總RNA或mRNA模板合成cDNA*鏈。

4．的逆轉(zhuǎn)錄效率：新穎突變位點大幅提升酶活性能，獲得更高產(chǎn)量的cDNA。

注意事項

1．在操作過程中應(yīng)避免RNase污染，防止RNA降解或?qū)嶒炛械慕徊嫖廴?，建議操作人

   員帶口罩和一次性手套并經(jīng)常更換手套，使用專門的儀器和耗材。

2．逆轉(zhuǎn)錄體系配制在冰上進(jìn)行操作，防止RNA發(fā)生降解。試劑盒的酶使用后盡快置于

   -20 oC保存，并盡量避免反復(fù)凍融。

3．反應(yīng)體系可倍比放大，10 μl反應(yīng)體系可zui大使用1μg總RNA。

4．Primer Mix由Oligo(dT)和Random primer配制而成，也可根據(jù)實驗需要選用

   Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer。

5．若起始RNA的量小于50 ng，建議加入RNA酶抑制劑（RNasin）。本試劑盒并未提

   供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號為YJ0596。

6．對于二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜的RNA模板，建議在操作步驟之前，將模板RNA在65℃孵育5分

   鐘立刻置于冰上，短暫離心后進(jìn)行下一步操作。

操作步驟

    將模板RNA在冰上解凍；試劑盒組分在室溫解凍后立刻置于冰上。使用前將每種溶

液渦旋振蕩混勻，并經(jīng)短暫離心后使用。

一、去除基因組DNA反應(yīng)

1．根據(jù)以下表格在冰上配制反應(yīng)體系，總體積為10 μl。為了保證反應(yīng)液配制的準(zhǔn)確性，先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制預(yù)混體系，然后再分裝到每個反應(yīng)管中，zui后加入RNA樣品。

                    試劑                           10 μl反應(yīng)體系

                    10×gDNA Eraser Buffer          1 μl

                    gDNA Eraser                   0.5 μl

                    RNA Template1）               10 pg-1 μg

                    RNase-Free Water             up to 10 μl

   注意：1）如果總RNA量大于1 μg，請按比例擴(kuò)大反應(yīng)體系。若起始RNA的量小于50 ng，則建議   

   加入RNA酶抑制劑（RNasin），該產(chǎn)品貨號為YJ0596。

2．渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

3．42℃孵育2分鐘（室溫反應(yīng)時，可以延長到30分鐘）。

4．反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。

二、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

1．根據(jù)以下表格在冰上配制反應(yīng)體系，反應(yīng)液配制請在冰上進(jìn)行。為了保證反應(yīng)液配置的

   準(zhǔn)確性，先按數(shù)+2的量配制成預(yù)混溶液，然后再分裝 10 μl到每個反應(yīng)管中，取配制的預(yù)混液10 μl加入至已完成去基因組的步驟1反應(yīng)管中。

                    試劑                           20 μl反應(yīng)體系

                    步驟1反應(yīng)液                         10 μl

                    HiFiScript，200 U/μl            1 μl

                    Primer Mix 1）                  1 μl

                    5×RT Buffer                    4 μl

                    RNase-Free Water               4 μl

   注意：1）  可根據(jù)實驗需要可使用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，建議20 μl 反應(yīng)體Oligo-dT Primer 50pmol，或Gene Specific Primer 2 pmol。

1. 混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。
2. 3．cDNA合成反應(yīng)條件：

     1）若下游進(jìn)行熒光定量PCR檢測，42℃孵育15分鐘，85℃孵育5分鐘。

     2）若下游進(jìn)行普通PCR檢測，42℃孵育30-50分鐘，85℃孵育5分鐘。

注意：對于二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜或GC含量高的模板，可以提高逆轉(zhuǎn)錄溫度至50℃，增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄效率。

 4．反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心后置于冰上，再進(jìn)行后續(xù)PCR或熒光定量PCR，如果需要長時

      間保存，請置于-20℃。

  注意：進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)時，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加量應(yīng)不超過PCR反應(yīng)總體積的1/10。

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